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生体分子の一分子動態解析

生命活動を担うタンパク質や核酸などの生体分子は, 活性部位での反応に伴う構造変化や局所的な物性変化, さらには周囲の分子との相互作用など様々な動的現象を通して独自の機能を発現しています. 生体分子がどのようにして機能しているか, その分子機構を理解するには分子の振る舞いを高い精度で計測する必要があります. 生体分子の機能と構造を調べるために, 生化学的分析手法, 光学顕微鏡法, X線回折法, 核磁気共鳴等の様々な分析・計測手段がこれまで開発されてきました. 一分子光学顕微鏡を用いると蛍光色素やビーズなどで標識した個々の分子の動きを追うこともできますし, 光あるいは磁気ピンセットなどで分子に力学的操作を加えながら, その際の振る舞いを計測できるようにもなっています. しかしながら, 光学顕微鏡をベースとした手法では計測されるのは分子そのものではなく, 標識の動きであり, 分子そのものの構造とのその変化を同時に観察することはできません.また, 蛍光顕微鏡では一分子の解像度を達成するには分子の濃度が十分低いなどの実際上の制限もあります. 分子の構造とその時間変化に関する直接的な情報を得るためには, ナノメータースケールの高い空間分解能で溶液中にある分子を可視化できる顕微鏡技術が必要です。

原子間力顕微鏡

Priciple of AFM原子間力顕微鏡(Atomic Force Microscope: AFM)は, 1986年にG. Binning(IBMチューリッヒ)とC. Quate(スタンフォード大学)らによって発明されました1). G. Binningは1982年に走査型トンネル顕微鏡(Scanning Tunneling Microscope)2)を発明し1986年にはノーベル物理学賞を受賞していますが, STMではトンネル電流を計測するために導電性の試料しか観察できませんでした. AFMでは絶縁体試料でも高解像な試料表面構造の観察ができることから, 今ではナノサイエンスに欠かせない計測装置の一つになっています. AFM では柔らかい板バネ(カンチレバー)の先端に取り付けた先鋭な探針(プローブ)を試料表面に接触させ, プローブと試料との間に働く力学的相互作用をカンチレバーの変位によって検出します.プローブに作用する力を2次元マッピングすることで対象物の表面構造を画像化できます. 力としてクーロン力や磁気力を検出することで, 局所的な電気的情報をマッピングすることもできます. また, カンチレバーの振動を解析することで試料の局所機械特性を測ることもでき, 表面構造と同時に様々な物性情報を高解像に画像できます(STM, AFMから派生した多くの顕微鏡技術があり, 総称して走査型プローブ顕微鏡と呼ばれます).
AFMの大きな特徴の一つは動作環境を選ばないことで, 真空・大気中はもちろん溶液中にある試料でも観察できます. そのため, 発明直後から溶液動作AFMの開発と生体試料観察への応用が精力的に行われ, 現在までに多種様々なタンパク質, 核酸, 染色体から細胞まで多岐にわたる試料の観察が報告されています2)。一方で, AFMは1枚の画像を取得するのに、数十秒から数分の時間が必要なため, 分子の拡散や集合などの分子間相互作用や分子自体の構造変化など動きを伴う現象を観察することは困難でした。

  1. G. Binnig, C. F. Quate, & Ch. Gerber, "Atomic Force Microscope", Phys. Rev. Lett. 56, 930–933 (1986).
  2. G. Binnig, H. Rohrer, Ch. Gerber & E. Weibel, "Surface studies by Scanning Tunneling Microscopy", Phys. Rev. Lett. 49 57–61 (1982).

高速原子間力顕微鏡

Schematics of AFM Priciple of AFMAFMにはいくつかの操作モードが提案されていますが, 生体分子のような柔らかい試料に対しては通常タッピングモードと呼ばれる方式がよく使われています。高速AFMもタッピングモードを採用しています. タッピングモードでは, プローブが付いたカンチレバーを圧電素子により機械的共振周波数で振動させ, プローブが試料に間欠接触したときのカンチレバーの振動振幅の変化を光てこ法により検出します. プローブを試料に対してラスター走査しながら, PIDフィードバック制御によりカンチレバーの振動振幅が設定値と等しくなるようにZ方向の圧電素子の伸縮を制御し, プローブと試料間距離が一定に保ちます. このとき, 2次元走査の各ピクセル位置でのPID信号をコンピュータに取り込むことで表面形状像を得ることができます. AFMのフレームレートを上げるには, AFMに含まれる要素を全て高速に動作するようにしなければなりません. これまでいくつかの研究グループにより, AFMの時間分解能の向上と生体試料のダイナミクス観察が試みられてきました. 1989年には血液凝固因子のひとつであるフィビリノーゲンが重合過程する様子を約8秒のフレーム間隔で観察した例も報告されています1). 1990年代には, 数秒程度のイメージング速度で生体分子をAFM観察した例が数多く報告されましたが, 脆弱な生体分子の機能を損なわずに, かつ, 生体分子が機能する時間スケール(通常, 1秒以下)でイメージングすることに成功したグループはありませんでした. 金沢大学の安藤敏夫教授はタンパク質の構造ダイナミクスを観察できる装置を目標に, 1993年頃からAFMの高速化に着手し, 2001年にマイカ基板に吸着したタンパク質の動態を80ms/frameで画像化することに成功しました2). 内橋も2004年に安藤グループに参加し高速AFMの改良と応用に取り組んできました. 低侵襲化や高分解能化, 操作性の向上といった高速AFMの技術改良にの結果, 2008年頃に生動態や分子の拡散・集合過程などのダイナミクスを高速撮影できる装置が2008年頃に完成しました3). 以来多くの応用研究が世界中で行われています4). どんな観察ができるかは動画ギャラリーをご覧ください.

  1. B. Drake B, C. B. Prater, A. L. Weisenhorn, S. A. Gould, T. R. Albrecht, C. F. Quate, D. S. Cannell, H. G. Hansma & P. K. Hansma, "Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope" Science Science 24, 1586–1589 (1989).
  2. T. Ando, N. Kodera, E. Takai, D. Maruyama, K. Saito & A. Toda, "A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules", Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 12468–12472 (2001).
  3. T. Ando, T. Uchihashi & T. Fukuma, "High-speed atomic force microscopy for nano-visualization of dynamic biomolecular processes", Prog. Surf. Sci. 83, 337–437 (2008).
  4. T. Ando, T. Uchihashi & S. Scheuring, "Filming biomolecular processes by high-speed atomic force microscopy", Chem. Rev. 114, 3120–3188 (2014).

高速原子間力顕微鏡の機能拡張

1. 広域観察用高速AFMの開発

Wide Scanner高速AFMはタンパク質などのサイズが数十nm程度の比較的小さな試料をターゲットに開発が進められてきました. 一方, 細胞やバクテリアのような比較的大きな試料を観察するためには, 数〜数十ミクロンの範囲を高速で走査しなければなりません. プローブ顕微鏡の2次元走査に使われる圧電素子の伸び係数を大きくするためには圧電素子自体のサイズが大きくなります. しかし, 圧電素子のサイズが大きくなると機械的共振周波数も低下するために, 高速で動かすことが困難になります. さらに, 圧電素子の非線形な動作も問題になります. 圧電素子の変位をてこの原理により拡大し, さらに, 共振周波数の低下による機械振動を低減するための信号処理や機械制御を駆使して60μm四方の範囲を数秒で画像化できる広域スキャナーを開発し, 細胞の形態変化の観察に応用しています1, 2). 観察例は動画ギャラリーをご覧ください.

  1. H. Watanabe, T. Uchihashi, T. Kobashi, M. Shibata, J. Nishiyama, R. Yasuda & T. Ando, "Wide-area scanner for high-speed atomic force microscopy", Rev. Sci. Instrum. 84, 053702 (2013).
  2. M. Shibata, T. Uchihashi, T. Ando & R. Yasuda, "Long-tip high-speed atomic force microscopy for nanometer-scale imaging in live cells", Scientific Reports 5, 8724 (7 pp) (2015).

2. 高速AFM/一分子蛍光顕微鏡複合機の開発

Stand-Alone HS-AFMStando-Alone HS-AFM OverviewATP(アデノシン三リン酸)やGTP(グアノシン三リン酸)の結合と加水分解によるエネルギーで動作するタンパク質などを研究するとき, 基質のタンパク質への結合と解離がタンパク質の構造変化とどのように共役しているかを知ることがタンパク質の化学-力学変換の分子機構を理解するためには非常に重要になります. 高速AFMではタンパク質の動態を可視化できますが, ATPなどの低分子化合物は小さすぎて直接観察することはできません. 一方, 蛍光顕微鏡では基質に蛍光色素を結合させた蛍光性基質を使うことで, 基質のタンパク質への結合や解離を観察できます. しかし、蛍光顕微鏡では同時にタンパク質の構造変化を直接見ることはできません. 高速AFMと蛍光顕微鏡を複合化し, 二つの顕微鏡を同時に同視野を観察すれば, 基質の結合や解離とタンパク質の構造変化のタイミングを知ることができると期待されます. また, AFMはプローブで触るものは全部可視化してしまうので, 例えば数種類の分子が相互作用しており, それらのタンパク質の形状が同じように観察されると, AFMで見えているものがどのタンパク質に対応するのかを知ることは困難です. 蛍光顕微鏡は蛍光標識された分子だけが計測にかかるので, 複雑な系でもターゲット分子の動きを捉えることができます. 複合化によって, 数種類の分子が関与する比較的複雑な試料に高速AFMを適用することができるかもしれません。高速AFM/一分子蛍光顕微鏡複合機は二つの顕微鏡の短所を補い合う画期的な装置です. 高速AFMを光学顕微鏡のステージに載せて動かすことは, いろいろな制約がありなかなか困難ですが, 5年ほどの歳月をかけ, いくつもの要素技術を開発することで高速AFMと蛍光顕微鏡で一分子を同時観察することに成功しました1). まだ解決しなければいけない技術的問題はあるものの, タンパク質の作動機構を詳細に調べる強力な武器になると考えています.

  1. S. Fukuda, T. Uchihashi, R. Iino, Y. Okazaki, M. Yoshida, K. Igarashi & T. Ando, "High-speed atomic force microscope combined with single-molecule fluorescence microscope", Rev. Sci. Instrum. 84, 073706 (2013).

3. 電気化学計測

Electrochemical HS-AFMバイオエレクトロニクスの分野において, タンパク質分子をはじめとする生体分子が電極界面でどのように存在し, 振る舞っているのかという情報は極めて重要です. 酸化還元酵素のような電子の授受と機能が密接に関係したタンパク質の電極上での吸着状態や向き, 吸着量, 電場をかけた際の動的挙動を知ることは, より高性能なデバイスを作製するために非常に重要です. HS-AFMの構成を基本とし、電気化学測定装置を組み合わせた電気化学HS-AFM装置の開発を行っています1).

  1. K. Takeda, T. Uchihashi, H. Watanabe, T. Ishida, K. Igarashi, N. Nakamura & H. Ohno, "Real-time dynamic adsorption processes of cytochrome c on an electrode observed through electrochemical high-speed atomic force microscopy", PLoS One 10(2), e0116685 (10 pages) (2015).

4. その他

上記の他にも, 溶液の温度を制御したり構造と同時に局所物性の計測ができるような様々な機能拡張に向けた装置開発を行っています1). 現行の高速AFMの性能や操作性向上のための技術開発も継続して行っています. 高速AFMの動画から得られるデータは膨大な量に及びますが, 効率的に解析するソフトウェアは世の中に存在しません. 膨大なAFM画像から必要な情報を自動的に抽出できるような新しい画像解析ソフトウェアの開発も行っています.
  1. T. Uchihashi, H. Yamashita & T. Ando, "Fast phase imaging in liquids using a rapid scan atomic force microscope", Appl. Phys. Lett. 89, 213112 (3 pages) (2006).